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银杏叶提取物对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

银杏合同 2020-10-15 03:00:50 0
[关键词] 银杏叶提取物

银杏叶提取物对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

[摘要]目的:探讨银杏叶提取物对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用及其机制 机制。 方法:将27只新西兰白兔随机分为假手术组,模型组和银杏叶提取物治疗组,每组9只。 建立兔脊髓IR模型。 在24和48小时的脊髓IR前后对实验兔后肢的运动功能进行评分,检测缺血性脊髓组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量,并检测缺血性 脊髓组织神经细胞的凋亡指数以及Bcl2和Bax蛋白的表达水平。 结果:银杏叶提取物能显着改善脊髓IR后实验兔的后肢运动功能。 增加脊髓组织中SOD的活性并降低MDA水平; 通过上调Bcl2和下调神经细胞Bax蛋白凋亡的表达来抑制IR引起的脊髓。 结论:银杏叶提取物对脊髓IR损伤有一定的保护作用,其机制可能与减轻脊髓神经细胞脂质过氧化损伤和抑制神经细胞凋亡有关。

[关键字] 银杏叶提取物; 再灌注损伤; 细胞凋亡 脊髓; 脂质过氧化作用观察金银花提取物对脊髓再灌注后缺血再灌注(IR)的保护作用,以寻找可能的机制。方法:二十七种新西兰白兔子othreegroups,whichwereshamoperationgroup,untreatedgroupandginkgoleafextractstreatedgroup.Thelocomotorscoresofhindlimbsinrabbitsafter24and48hofreperfusionwereevaluated,andtheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andthecontentofmalondialdehyde(MDA)inischemiaspinalcordwereexamined.Theapoptoticindex(AI)ofneuronsinspinalcordwasdetectedbyterminaldeoxyribonucleotidyltransferase酶(TdT)mediateddUTPbiotinnickendlabeling(TUNEL)method.TheexpressionsofBcl2andBaxproteinswereexaminedbystreptavidinbiotinperoxidasemethod.Results:Thelocomotorscoresofhindlimbsinrabbitsafter24and48hofreperfusionintheginkgoleafextractstreatedgroupwereobviouslyelevatedascomparedwiththoseintheuntreatedgroup(P <0.05).TheactivityofSODwashigherandthelevelofMDAwaslowerinischemiaspinalcordintheginkgoleafextractstreatedgroupthanthoseintheunt观察组(P <0.01)。观察到银杏叶提取物治疗组神经元AI的下降和Bcl2蛋白上调和Bax蛋白下调的表达。 预防IR引起的脊髓软蛋白损害的保护作用可能与清除氧自由基,减少脂质过氧化损伤和抑制细胞凋亡有关。

关键词 再灌注损伤 细胞凋亡 脊髓; 脂质过氧化

银杏 银杏部分的叶提取物从植物银杏的叶子中提取的有效成分,研究表明它对心脏的缺血再灌注(IR)损伤具有保护作用 ,脑,肝,肾和其他器官,但是它是否对脊髓缺血再灌注损伤具有保护作用该保护作用鲜有报道。 本研究利用兔腹主动脉阻断剂建立脊髓IR损伤模型,探讨银杏叶提取物对脊髓IR损伤的保护作用及其机制,为临床应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物,清洁级1​​级,雌,雄,体重2.4〜的成年新西兰成年白兔27只 西安交通大学实验动物中心提供,平均3.1kg,平均2.7kg,证书编号:益东字08018。

1.1.2试剂盒细胞凋亡试剂盒,Bcl2和Bax蛋白免疫组化 染色试剂盒购自武汉博斯特生物工程公司。 超氧化物歧化酶去歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测试套件购自南京建城生物工程研究所。

1.1.3医学银杏叶提取物是德国WillmarSchwabe制药厂生产的Ginaton注射剂,批号668110,含有24%的类黄酮糖苷,6%的萜烯内酯(包括银杏内酯A,B ,C,J和白果内酯)和70%的其他物质(果酸,糖等)。

1.2用Zivin [1]方法制备兔脊髓IR损伤模型,并以静脉注射戊巴比妥30 mg / kg麻醉兔,麻醉开始后0.5 cm。 兔左肾动脉钳住腹主动脉30分钟,然后取下血管钳进行再灌注。

1.3动物分组和药物治疗将27只白兔随机分为3组:假手术组,模型组和银杏叶提取物治疗组,每组9只。 银杏叶提取物治疗组在腹主动脉夹闭前和再灌注开始后30分钟接受静脉注射银杏叶提取物100 mg / kg。 模型组用相同量的生理盐水代替了银杏叶提取物。 在假手术组中,仅暴露腹主动脉,未夹持血管,未给予药物治疗。

1.4兔后肢运动功能评分在再灌注后24和48小时,采用单盲法对兔后肢运动功能进行评分[2]:完全后肢瘫痪,0分。 后肢严重瘫痪1分; 后肢可以移动,但不能跳动2分; 后肢可以跳跃但明显不稳定,为3分; 后肢可以跳跃但稍微不稳定,为4分; 后肢的运动功能完全正常,为5分。

1.5脊髓组织指数检测

1.5.1再灌注后48h脊髓组织MDA,SOD含量检测,取缺血部位的脊髓组织,称重,制成 匀浆。 用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量。 用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的含量。 根据试剂盒说明执行操作步骤。 使用考马斯亮蓝G250方法定量组织蛋白。

1.5.2在再灌注后48h,检测脊髓组织中细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达,并检测脊髓前角灰质。 结束氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyltransferase,TdT)介导的生物素dUTP缺口末端标记(TdT介导的UTP生物素缺口末端标记,TUNEL)法原位检测再灌注脊髓细胞凋亡; 使用免疫组织化学链霉亲和素过氧化物酶连接法(streptavidinbiotinperoxidasemethod,SP)检测Bcl2和Bax蛋白的表达。 根据试剂盒说明执行操作步骤。 肯定的标准:TUNEL方法是指核和核膜被染成棕色。 SP法是指细胞质被染成褐色。

1.5.3计算机图像分析使用图像分析仪(×900)观察每组实验兔L5脊髓前角灰质的凋亡和免疫组化切片。 每个部分随机选择10个视野。 计算凋亡指数(凋亡指数,AI)以及Bcl2和Bax蛋白的表达水平。

1.6统计方法使用SPSS10.0软件进行统计分析。 测量数据的平均值由x±s表示。 两种样本均值的比较通过t检验进行。 后肢运动功能评分的比较通过秩和检验进行。

2结果

2.1 银杏叶提取物对假手术组实验兔神经运动功能的影响。 缺血再灌注后,模型组和银杏叶提取物处理组的实验兔均不同程度地瘫痪。 再灌注后24至48小时,一些后肢的运动功能再次恶化,甚至发生第二次麻痹。 银杏叶片提取物治疗组的实验兔后肢运动功能恢复优于模型组。 两组在IR后24和48h有统计学差异。 参见表1。

2.2 银杏叶提取物对脊髓组织中SOD和MDA含量的影响假手术组实验兔的脊髓组织中SOD含量较高,而 MDA处于较低水平。 模型组的SOD含量显着降低,MDA含量显着升高,与假手术组相比差异有统计学意义。 银杏与模型组相比,叶提取物处理组的SOD含量显着增加,MDA含量显着下降,差异具有统计学意义意义。 见表2。

假手术组未观察到2.3 银杏叶提取物对脊髓神经细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响

假手术组未见神经细胞凋亡, Bcl2,Bax蛋白也以极少量表达。 在模型组的脊髓组织中可以看到大量的凋亡细胞。 Bax蛋白在缺血组织中大量表达,而Bcl2蛋白表达则较低,二者之比失衡。 与模型组相比,银杏叶提取物处理组凋亡细胞明显减少,Bax蛋白表达明显降低,Bcl2蛋白表达增加,差异具有统计学意义。 参见表3和图1-7。

表1 银杏叶提取物处理组和模型组在IR(省略)后24和48 h处实验兔后肢运动功能评分

表1在24和48h的再灌注处理后和未处理组中,后肢的运动分数 p> * P <0.05,vsginkgoleaf提取物治疗组。

表2 IR(省略)后48h,各组实验兔脊髓组织的SOD活性和MDA含量

表2 48组再灌注后48组再灌注后MDA尼尼西非脊髓可可碱的SOD活性和含量; vs治疗组;△△P <0.01; vsshamoperation组。表3 AI,Bcl2和Bax蛋白在实验兔脊髓组织中的表达 红外照射后48h各组(略)

表3AI及48组再灌注48h后Bcl2和Bax蛋白sinischemiaspinalcordin兔的表达

p>

** P<0.01,vs治疗组;△△P <0.01,vsshamoperation。

图1兔脊髓IR损伤后48h各组脊髓神经细胞凋亡(TUNEL法×200)(略) / p>

图1 48组再灌注后48组再灌注后神经细胞凋亡性脊髓神经坏死兔

A:假手术组; B:未治疗组; C:银杏叶提取物治疗组。

图2 IR损伤48h兔脊髓组织中Bax蛋白的表达 (SP方法,×400)(略)

图2 48hof再灌注后Bax蛋白表达的缺血性脊髓性cordinrabbits

A:未治疗组; B:Ginkgoleaf提取物治疗组。

图3 Bcl2蛋白在脊髓组织中的表达 48h再灌注后48h(SP法,×400)(略)的IR损伤后的家兔

图3Bcl2蛋白表达缺血性脊髓性cordin兔比特

A:未治疗组; B:银杏叶提取物治疗组。

3讨论

红外损伤时最重要的有毒物质是自由基, 轻微的过氧化是主要的损伤机制。 脊髓发生IR后,大量产生ATP代谢物,如黄嘌呤,次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶,并产生大量的氧自由基[3],这些氧自由基作用于细胞膜磷脂,对溶酶体造成损害, 线粒体和细胞膜。 神经组织中的脂质含量很高,因此脊髓对自由基引起的脂质过氧化特别敏感。 自由基可以通过多种方式(膜损伤,线粒体损伤,直接DNA损伤等)引起脊髓神经细胞不同程度的凋亡或坏死。 该实验的结果发现,脊髓IR损伤的动物的后肢运动功能评分显着低于假手术组。 脊髓组织中脂质过氧化产物MDA的含量增加,而抗氧化酶SOD的含量明显降低。 具有统计学意义,证实了氧自由基对脊髓IR的损伤作用。

过去,人们认为脊髓缺血后神经细胞的死亡方式是无血管坏死。 然而,近年来的研究表明,凋亡可能是脊髓缺血后神经细胞死亡的主要途径。 林等。 [4]报道,脊髓IR损伤后,运动神经元的死亡主要与细胞凋亡程序的激活有关。 凋亡与多种机制有关,例如自由基的作用和基因调控。 氧自由基可通过脂质过氧化损伤细胞膜和线粒体膜来诱导促凋亡相关蛋白的表达,并启动细胞凋亡程序。 大量研究表明,氧自由基可以通过启动Bcl2,Bax和其他凋亡相关因子来诱导细胞凋亡[5]。 Bcl2和Bax是重要的细胞凋亡调控基因。 前者抑制细胞凋亡,而后者促进细胞凋亡。 Bcl2和Bax表达的比例可以表明细胞是否经历凋亡。 当两者的比例增加时,它将促进细胞存活,否则细胞将死亡[6]。 实验结果表明,假手术组脊髓组织中Bax和Bcl2蛋白的表达基本为阴性。 模型组可见大量的凋亡细胞。 Bax蛋白在缺血性脊髓组织中大量表达,而Bcl2的表达则较低。 该比例的不平衡与自由基的变化一致,表明自由基在脊髓IR损伤期间在细胞凋亡中起重要作用。

银杏叶提取物包含两种主要活性成分,黄酮苷和萜烯内酯,它们具有清除自由基的明显作用。 其中,类黄酮(山ka酚,槲皮素,异鼠李素等)可显着降低超氧阴离子自由基的浓度。 Xin等。 [7]报道,银杏叶提取物可通过清除自由基来保护小脑颗粒细胞免受过氧化物的损害,并可以抵抗自由基诱导的神经元凋亡。 史密斯等。 [8]报道银杏叶提取物可以上调PC12细胞中Bcl2的表达,抑制caspase3的激活,下调caspase12并减少细胞色素C的释放,并可以减少DNA断裂的发生,从而减少细胞凋亡。 Unal等。 [9]发现长期服用银杏叶提取物可以增加大鼠局灶性脑缺血后Bcl2基因的表达。 实验结果表明,银杏叶提取物可显着降低IR后脊髓组织中MDA的含量,并保护SOD的活性,提示银杏叶提取物可减少氧自由基介导的脂质过氧化反应。 。 脊髓损伤。 银杏叶提取物还可以抑制脊髓IR后Bax基因的表达,并诱导Bcl2基因的表达,表明它可以通过调节凋亡相关基因的表达来抑制IR后脊髓的凋亡。 实验结果还表明,银杏叶提取物具有较好的清除氧自由基的作用,并且可以通过抵抗氧自由基的破坏来调节凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达,并抑制脊髓的凋亡。 IR后神经细胞。 对脊髓IR损伤有一定的保护作用。

[参考文献]

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3BasuS,HellbergA,UlusAT,etal.SpinalcordischemaArai造成的自由基损伤的生物标志物,2001,Mal.5081。eK,etal。脊髓缺血后半胱氨酸蛋白酶诱导的运动神经元凋亡。中风,1998,29(5):10071012。

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9UnalI,GursoyOzdemirY,BolayH,等 .BrainRes,2001,917(2):174181。 [H]

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